歡迎來(lái)到蘇州裕宸儀器有限公司網(wǎng)站！
提起 PCR，在生物及其相關(guān)行業(yè)內可謂如雷貫耳，**，其影響之深，應用之廣可見(jiàn)一斑。
1985 年，美國 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人發(fā)明了聚合酶鏈反應（PCR），實(shí)現了在試管中模擬細胞內的 DNA 復制。然而，采用 E-coli DNA 聚合酶進(jìn)行 PCR，由于該酶不耐熱，使這一過(guò)程耗時(shí)，費力，且易出錯。1988 年 Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌 (thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱 DNA 聚合酶。 耐熱 DNA 聚合酶的應用使得 PCR 能率的進(jìn)行，隨后 PE-Cetus 公司推出了臺 PCR 自動(dòng)化熱循環(huán)儀，從此拉開(kāi)了 PCR 大展拳腳的序幕。
根據 PCR 的發(fā)展進(jìn)程，本文將對普通 PCR、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和數字 PCR 這三代 PCR 進(jìn)行分析，期望對 PCR 感興趣的讀者能從中有所收獲。
普通 PCR
基本原理
PCR（聚合酶鏈式反應）是一種體外 DNA 擴增技術(shù)，是在模板 DNA、引物和 4 種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴(lài)于 DNA 聚合酶的酶促合反應，將待擴增的 DNA 片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經(jīng)「高溫變性—低溫退火 —引物延伸」三步反應的多次循環(huán)，使 DNA 片段在數量上呈指數增加，從而在短時(shí)間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留復制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。
PCR 反應體系舉例
| 10×擴增緩沖液 | 10µl |
| 4 種 dNTP 混合物 | 各 100～250μmol/L |
| 引物 | 各 5～20μmol/L |
| 模板 DNA | 0.1～2µg |
| Taq DNA 聚合酶 | 5~10U |
| Mg2+ | 1～3mmol/L |
| 加雙或三蒸水至 | 100µl |
儀器與耗材
基于聚合酶制造的 PCR 儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設備，能在變性溫度、復性溫度和延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，在此不再贅述。
結果檢測
PCR 反應擴增出很高的拷貝數，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是常用的檢測手段。電泳法檢測特異性不太高，引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判，但因為其簡(jiǎn)捷易行，成為了主流檢測方法。
應用
PCR 是一種用于放大擴增特定的 DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊 DNA 復制，大特點(diǎn)是能將微量的 DNA 大幅增加。因此，無(wú)論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點(diǎn)的 DNA，就能用 PCR 加以放大，進(jìn)行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）
基本原理
qPCR 技術(shù)是在反應體系中加入熒光報告基團和熒光淬滅基團，隨著(zhù) PCR 反應的進(jìn)行，擴增產(chǎn)物不斷積累，導致熒光信號不斷積累， 從而利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)監測整個(gè) PCR 進(jìn)程。
根據 PCR 定量原理公式可推導出， 模板起始拷貝數的對數與閾值循環(huán)數呈線(xiàn)性關(guān)系，模板起始拷貝數越多，熒光信號達到閾值的循環(huán)數越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數的標準樣品繪制標準曲線(xiàn)，根據熒光基團發(fā)出的熒光強度與 PCR 擴增產(chǎn)物的數量呈對應關(guān)系， 只要對熒光信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監測并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過(guò)標準曲線(xiàn)計算未知樣品的起始拷貝數。
Ct 值指 PCR 擴增過(guò)程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴增循環(huán)數。相同模板進(jìn)行 96 次擴增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定，但 Ct 值卻重現性。
模板 DNA 量越多，熒光達到域值的循環(huán)數越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線(xiàn)性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線(xiàn)，根據樣品 Ct 值，就可以計算出樣品中所含的模板量。
目前常用熒光標記方法
| 方法 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) | 應用范圍 |
| SYBR Green I | 適用性廣 靈敏 方便 便宜 | 引物要求高 易出現非特異條帶 | 科研中對各種目的基因定量分析，基因表達量的研究，轉基因重組動(dòng)植物研究 |
| Taqman | 特異性高 重復性好 | 價(jià)格高 只適合特定目標 | 病原體檢測，疾病耐藥基因研究，藥物療效考核，遺傳疾病診斷 |
| 分子信標 | 高特異性 熒光背景低 | 只適合特定目標 設計困難 價(jià)格高 | 特定基因分析，SNP分析 |
| 熒光定量 PCR 反應體系舉例 | |
| 試劑 | 含量 |
| 2xGoTaq Master Mix | 5µl |
| 無(wú)核酸酶水 | 3.5µl |
| 上游引物 | 0.25µl |
| 下游引物 | 0.25µl |
| 基因組 DNA | 1µl（約20ng）梯度稀釋 |
| 共 10µl | |
儀器與耗材
在普通 PCR 儀的基礎上增加一個(gè)熒光信號采集系統和計算機分析處理系統，就成了熒光定量 PCR 儀。其 PCR 擴增原理和普通 PCR 儀擴增原理相同，只是 PCR 擴增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過(guò)熒光信號采集系統實(shí)時(shí)采集信號連接輸送到計算機分析處理系統得出量化的實(shí)時(shí)結果輸出，把這 PCR 儀叫做實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀 (qPCR 儀)。熒光定量 PCR 儀有單通道，雙通道，和多通道。當只用一種熒光探針標記的時(shí)候，選用單通道，有多熒光標記的時(shí)候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記的目的基因表達產(chǎn)物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫學(xué)臨床檢測，生物醫藥研發(fā)，食品行業(yè)，科研院校等機構。